Selulosa yang keberadaannya melimpah dalam ampas tebu potensinya dapat ditingkatkan dengan modifikasi ukuran partikel hingga nanometer, yang disebut nano selulosa. Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimen laboratoris yang bertujuan untuk mensintesis dan mengkarakterisasi nanoselulosa dari ampas tebu hitam (Saccharum officinarum L.) sebagai upaya pemanfaatan limbah biomassa menjadi material fungsional bernilai tinggi. Metode sintesis nanoselulosa dalam penelitian ini mengkombinasikan metode kimia dengan hidrolisis asam (H2SO4) 1 % (v/v) dan mekanik dengan ultrasonikasi selama 120 menit. Subjek yang terlibat dalam penelitian ini adalah sampel ampas tebu hitam yang diperoleh dari limbah hasil penggilingan tebu di pabrik pengolahan lokal, yang kemudian diambil secara purposif sebagai bahan utama untuk diekstraksi nanoselulosanya. Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini meliputi spektrofotometer FTIR, difraktometer sinar-X (XRD), mikroskop elektron (SEM/TEM), serta analisis termogravimetri (TGA/DTG) untuk mengamati struktur kimia, kristalinitas, morfologi, dan stabilitas termal nano selulosa. Data dianalisis secara deskriptif kuantitatif dengan membandingkan parameter hasil karakterisasi terhadap standar nanoselulosa yang telah diketahui dalam literatur. Hasil penelitian menunjukan bahwa metode kombinasi menghasilkan partikel nano berukuran antara 44,42 – 184,7 nm, potensial zeta sebesar -29,41 mV, kristalinitas 33,7%, luas permukaan spesifik sebesar 88,0842 m2/g, dan daya adsorpsi terhadap metilen biru sebesar 23,7435 mg/g. Metode ini dibuktikan mampu lebih efektif dan efisien dalam mensintesis nanoselulosa. Implikasi dari penelitian ini adalah penerapan metode kombinasi dalam proses sintesis nanoselulosa menghasilkan nanoselulosa dengan tolakan elektrostatik lebih kuat, permukaan yang luas, derajat kristalinitas meningkat, dan keberadaan gugus fungsi serta struktur kristal yang tidak berubah.