Peningkatan kompetensi tenaga kesehatan merupakan salah satu strategi penting dalam meningkatkan mutu pelayanan dan keselamatan pasien di rumah sakit. Pelatihan preceptorship dan mentorship merupakan metode pengembangan sumber daya manusia yang bertujuan meningkatkan kemampuan pembimbing klinik dalam melaksanakan proses bimbingan secara efektif. Namun, bukti mengenai efektivitas pelatihan tersebut terhadap peningkatan pengetahuan tenaga kesehatan di rumah sakit masih terbatas. Tujuan penelitian ini untuk menganalisis efektivitas pelatihan preceptorship dan mentorship terhadap pengetahuan tenaga kesehatan di RSUD Panembahan Senopati Bantul. Penelitian ini menggunakan desain kuantitatif pre-experimental dengan rancangan one-group pretest-posttest. Penelitian dilaksanakan pada Desember 2025 di RSUD Panembahan Senopati Bantul. Populasi penelitian adalah 45 pembimbing klinik dengan teknik total sampling. Sebanyak 30 responden yang mengikuti seluruh rangkaian penelitian dianalisis sebagai sampel akhir. Pengukuran pengetahuan dilakukan menggunakan kuesioner sebelum dan sesudah pelatihan. Data dianalisis secara univariat, dilanjutkan uji normalitas Shapiro Wilk dan uji Wilcoxon Signed-Rank Test. Hasil penelitian ini mendapatkan rerata skor pengetahuan meningkat dari 63,20 pada pre-test menjadi 80,00 pada post-test, dengan peningkatan rerata sebesar 16,80 poin. Hasil uji Wilcoxon menunjukkan terdapat 21 responden mengalami peningkatan skor, 4 responden mengalami penurunan, dan 5 responden memiliki skor yang tetap. Analisis statistik menunjukkan perbedaan yang bermakna antara skor pengetahuan sebelum dan sesudah pelatihan (p = 0,000). Pelatihan preceptorship dan mentorship terbukti efektif meningkatkan pengetahuan tenaga kesehatan di RSUD Panembahan Senopati Bantul.