Pertumbuhan mikroorganisme sangat bergantung pada kualitas media yang kaya nutrisi terutama protein. Media Mannitol Salt Agar (MSA) umumnya digunakan untuk isolasi Staphylococcus aureus, namun ketersediaan produk komersial di pasaran relatif mahal. Oleh karena itu, diperlukan inovasi media alternatif berbahan dasar alami, seperti tulang dan daging ikan cakalang yang memiliki kandungan protein tinggi dan berpotensi mendukung pertumbuhan Staphylococcus aureus. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi penggunaan tulang dan daging ikan cakalang serta menganalisis efektivitas media MSA berbasis ikan cakalang sebagai pengganti pepton terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Penelitian ini bersifat true eksperimen dengan sampel berupa tulang dan daging ikan cakalang, menggunakan metode kultur bakteri yang dianalisis secara deskriptif dan menggunakan Uji T satu sampel. Penelitian ini dilaksanakan pada Februari – April Tahun 2025 di Laboratorium Mikrobiologi Teknologi Laboratorium Medis Poltekkes Kemenkes Makassar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa media inovatif berbahan ikan cakalang pada variasi konentrasi 1%,2%,3%,4%,5%, dan 6% mampu mendukung pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus serupa dengan media kontrol MSA. Selama masa inkubasi, konsentrasi 3% menunjukkan pertumbuhan koloni serta perubahan warna yang paling cepat dan menyerupai media kontrol. Berdasarkan hasil tersebut, ikan cakalang dapat digunakan sebagai bahan inovatif untuk pertumbuhan media MSA, dengan konsentrasi optimal 3%.