Ketersediaan nitrogen dan energi fermentabel merupakan faktor penting yang mendukung aktivitas mikroorganisme dan sintesis protein mikroba rumen. Substitusi urea dengan pupuk NPK Phonska dalam formulasi molasses block (MB) berpotensi memengaruhi karakteristik fermentasi rumen akibat perbedaan kandungan nitrogen dan mineral kedua bahan. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh substitusi urea dengan pupuk NPK Phonska dalam formulasi MB terhadap konsentrasi amonia (NH₃) dan efisiensi sintesis protein mikroba (ESPM) rumen secara in vitro. Penelitian menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan lima perlakuan dan empat kelompok berdasarkan pelaksanaan pengujian in vitro. Perlakuan terdiri atas P0 (urea 10%), P1 (urea 7,5% + Phonska 2,5%), P2 (urea 5% + Phonska 5%), P3 (urea 2,5% + Phonska 7,5%), dan P4 (Phonska 10% tanpa urea). Data dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan pada taraf signifikansi 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan proporsi urea dan pupuk NPK Phonska memberikan pengaruh nyata (P < 0,05) terhadap konsentrasi NH₃ dan ESPM. Konsentrasi NH₃ menurun dari 193,53 mg N-NH₃/L pada P0 menjadi 90,59 mg N-NH₃/L pada P4. Sebaliknya, nilai ESPM tertinggi diperoleh pada P4 sebesar 48,89 g N mikroba/kg bahan organik terfermentasi (BOTr), sedangkan nilai terendah terdapat pada P1 sebesar 36,23 g N mikroba/kg BOTr. Temuan ini menunjukkan bahwa perubahan proporsi urea dan pupuk NPK Phonska menghasilkan respons metabolisme nitrogen dan efisiensi sintesis protein mikroba yang berbeda. Namun, karena formulasi tidak disusun berdasarkan kesetaraan kandungan nitrogen, perbedaan respons tersebut belum dapat dikaitkan secara langsung dengan karakteristik masing-masing sumber nitrogen. Penelitian ini memberikan informasi awal mengenai respons fermentasi rumen secara in vitro, sedangkan keamanan penggunaan pupuk NPK Phonska sebagai bahan pakan masih memerlukan evaluasi lebih lanjut.