Tepung biji labu kuning memiliki kandungan nutrisi yang sangat potensial untuk digunakan sebagai bahan substitusi pada produk kuliner. Salah satu produk kuliner yang dapat dikembangkan dengan substitusi tepung ini adalah kue kering. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh substitusi tepung biji labu kuning terhadap kualitas organoleptik dan kimia. Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimen melalui uji coba pembuatan produk penelitian dengan kadar persentase tepung biji labu kuning sebesar 10%, 20%, 30%, dan 50% yang kemudian dilakukan uji kualitas organoleptik oleh panelis ahli. Hasil analisis kualitas organoleptik menyatakan bahwa persentase substitusi tepung biji labu kuning sebesar 10% dan 20% memiliki tingkat kualitas organoleptik yang tidak berbeda signifikan. Mengingat tujuan dari penelitian ini yang ingin menciptakan alternatif jajanan tinggi nutrisi, maka kadar substitusi yang dipilih adalah 20% dengan karakteristik organoleptik yaitu hijau kecokelatan, cukup beraroma mentega, cukup beraroma tepung biji labu kuning, cukup terasa manis, agak terasa tepung biji labu kuning, dan bertekstur renyah. Uji kualitas kimia dilakukan melalui uji proksimat pada SIG Laboratory. Berdasarkan hasil uji proksimat, terdapat peningkatan kadar protein (10,05%), lemak (35,04%), abu (1,8%), dan serat pangan (6,53%), serta penurunan kadar air (1,81%) dan karbohidrat (51,30%) pada produk substitusi tepung biji labu kuning sebesar 20% dibandingkan produk standar. Hasil ini menunjukkan bahwa substitusi tepung biji labu kuning sebesar 20% dapat meningkatkan nilai gizi dan mempertahankan mutu organoleptik kue kering Chui Kao So, sehingga berpotensi sebagai alternatif pangan fungsional yang lebih sehat.