Healthcare-Associated Infections (HAIs) atau infeksi nosokomial merupakan masalah yang serius bagi fasilitas pelayanan kesehatan di seluruh dunia, termasuk di Indonesia. Salah satu cara pencegahan utama adalah pelaksanaan Five Moment Hand Hygiene, yang meliputi lima momen penting mencuci tangan sesuai panduan WHO. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis hubungan antara tingkat pengetahuan petugas kesehatan tentang Five Moment Hand Hygiene dan pelaksanaannya di Puskesmas Sibiruang Koto Kampar Hulu. Penelitian menggunakan desain kuantitatif dengan metode cross-sectional. Populasi dalam penelitian ini adalah seluruh petugas kesehatan di Puskesmas Sibiruang Koto Kampar Hulu, dengan total sampel sebanyak 60 orang menggunakan teknik total sampling. Data dikumpulkan melalui kuesioner dan observasi langsung, kemudian dianalisis menggunakan analisis univariat dan bivariat dengan uji statistik Chi-Square. Analisis statistik menunjukkan hubungan yang signifikan antara tingkat pengetahuan dan pelaksanaan Five Moment Hand Hygiene dengan p-value sebesar 0,000 (<0,05). Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan pengetahuan petugas kesehatan berkontribusi langsung terhadap kepatuhan dalam pelaksanaan hand hygiene yang benar.