Kitooligosakarida merupakan derivat dari kitosan yang memiliki sifat antimikroba dan dijadikan bahan aktif dalam cairan hand sanitizer. Hand sanitizer bebas alkohol dapat menghindari terjadinya toleransi bakteri terhadap bahan kimia seperti alkohol dan mengurangi efek buruk alkohol bagi kulit. Penelitian bertujuan untuk mengetahui karakteristik sediaan hand sanitizer kitooligosakarida dan efektivitasnya dalam membunuh mikroba. Serbuk kitooligosakarida ditambahkan dalam formulasi hand sanitizer dengan variasi berat 1 g (formula 1), 1,5 g (formula 2), dan 2 g (formula 3) menggunakan basis NaCMC, propilenglikol, essens, dan metil paraben. Evaluasi stabilitas fisik hand sanitizer berdasarkan warna, tekstur, aroma, pH, homogenitas, dan daya sebar. Uji daya hambat hand sanitizer diuji melalui metode disc diffusion dilanjutkan dengan perbandingan daya hambat melalui pengukuran diameter zona penghambatan dan uji one-way ANOVA. Uji penurunan angka koloni mikroba dengan metode swabbing dan dilanjutkan perbandingan rerata penurunan koloni mikroba melalui uji T berpasangan. Hasil evaluasi stabilitas fisik hand sanitizer memenuhi kriteria gel yang baik. Hasil uji formula 1 memiliki kriteria angka diameter zona hambat yang lemah pada S. aureus (14,33 cm) dan daya hambat sedang pada E. coli (17,33 cm), Formula 2 memiliki angka diameter zona hambat kuat sebesar 21,33 cm pada S. aureus dan 20,33 cm pada E. coli. Formula 3 menghasilkan zona hambat kuat, yaitu 20,67 cm pada S. aureus dan 22,33 cm pada E. coli. Hasil penurunan angka koloni mikroba sediaan hand sanitizer paling besar yaitu formula 3 sebesar 80,22%. Hand sanitizer kitooligosakarida menunjukkan kemampuan penurunan angka koloni mikroba dan dapat digunakan sebagai formulasi alternatif hand sanitizer.