Upaya pemenuhan kebutuhan darah yang dilakukan pada kegiatan pelayanan darah salah satunya dengan mempertimbangkan kelayakan pada pendonor darah melalui tahap seleksi donor untuk menentukan layak donor dan tidak layak donor. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif kuantitatif dengan pendekatan retrospektif. Populasi dalam penelitian ini yaitu seluruh pendonor di Unit Donor Darah PMI Kabupaten Banyumas tahun 2022 sebanyak 101.841. Sampel dalam penelitian ini difokuskan pada calon pendonor darah yang tidak layak donor sebanyak 31.510. Teknik pengambilan sampel menggunakan teknik total sampling. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah calon pendonor sebanyak 101.841, dimana calon pendonor darah yang tidak layak donor sebanyak 31.510. Calon pendonor darah yang tidak layak usia >65 tahun lebih banyak pada mobile unit yaitu 15 (100%), berat badan <45 kilogram lebih banyak pada mobile unit yaitu 111 (100%), tekanan darah tinggi lebih banyak di dalam gedung yaitu 829 (60,21%), tekanan darah rendah lebih banyak pada mobile unit yaitu 4.432 (65,24%), kadar hemoglobin tinggi lebih banyak di dalam gedung yaitu 1.209 (23,80%) dan kadar hemoglobin rendah lebih banyak pada mobile unit yaitu 9.597 (80,15%) calon pendonor darah, berdasarkan faktor kondisi medis meliputi konsumsi obat, tato, bekam, haid, oprasi/bedah, vaksin, sakit, cabut gigi, berpergian luar kota, confirm, belum waktunya donor dan kondisi medis lainya mayoritas terbanyak pada konsumsi obat pada mobile unit yaitu 1.281 (84,28%) calon pendonor darah. Faktor penyebab ketidaklayakan calon pendonor darah di Unit Donor Darah PMI Kabupaten Banyumas tahun 2022 meliputi faktor usia, berat badan, tekanan darah, kadar hemoglobin dan kondisi medis. Mayoritas faktor penyebab ketidaklayakan calon pendonor darahh disebabkan oleh kadar hemoglobin rendah.