Kepatuhan penggunaan APD merupakan suatu tindakan dalam pencegahan kecelakaan kerja maupun penularan infeksi terutama di fasilitas pelayanan kesehatan. Karena rumah sakit merupakan sumber infeksi bagi petugas kesehatan, pasien dan pengunjung pasien. Tujuan Penelitian ini untuk mengetahui hubungan antara pengetahuan dengan tingkat kepatuhan penggunaan alat pelindung diri (APD) pada petugas kesehatan di RSIA Sitti Khadijah 1 Muhammadiyah Makassar Tahun 2022. Jenis penelitian yang digunakan adalah kuantitatif dengan desain penelitian cross sectional study. Sampel dalam penelitian ini yaitu 111 petugas kesehatan di bidang pelayanan medik RSIA Sitti Khadijah 1 Muhammadiyah Makassar Tahun 2022. Teknik sampling yang digunakan adalah total sampling. Penelitian ini menggunakan analisis univariat dan bivariat. Hasil uji bivariat pada penelitian ini menunjukan bahwa tidak terdapat pengaruh antara pengetahuan pada dimensi tahu (know) dengan tingkat kepatuhan penggunaan APD (p-value 0,529), terdapat pengaruh antara pengetahuan pada dimensi memahami (comprehension) dengan tingkat kepatuhan penggunaan APD (p-value 0,003), terdapat pengaruh antara pengetahuan pada dimensi aplikasi (application) dengan tingkat kepatuhan penggunaan APD (p-value 0,007), terdapat pengaruh antara pengetahuan pada dimensi analisis (analysis) dengan tingkat kepatuhan penggunaan APD (p-value 0,004), terdapat pengaruh antara pengetahuan pada dimensi sintesis (sythesis) dengan tingkat kepatuhan penggunaan APD (p-value 0,012), terdapat pengaruh antara pengetahuan pada dimensi evaluasi (evaluation) dengan tingkat kepatuhan penggunaan APD (p-value 0,002). Disarankan kepada pihak RSIA Sitti Khadijah 1 Muhammadiyah Makassar memberikan sosialisasi dan pelatihan bagi petugas kesehatan tentang penggunaan alat pelindung diri (APD).