Hand Hygiene merupakan salah satu pencegahan terjadinya infeksi silang di rumah sakit yang dapatmenggunakan sabun dan air mengalir ataupun antiseptik. Tujuan penelitian ini untuk menganalisispenerapan hand hygiene oleh penata anestesi di perioperatif RS X. Metode penelitian yang digunakanadalah kuantitatif dengan pendekatan deskriptif observasional. Populasi yang digunakan pada penelitian iniberjumlah 14 penata anestesi dengan sampel menggunakan rumus lemeshow dengan teknik work samplingdengan proportional stratified random sampling terdapat 68 sampel pengamatan hand hygiene. Instrumenpenelitian menggunakan lembar observasi hand hygiene menurut WHO yaitu five moment dan 6 langkah.Analisis datanya menggunakan univariat dengan distribusi frekuensi yang terdiri dari handwash danhandrub. Penelitian ini sudah dilakukan uji etik. Hasil penelitian data hand hygiene dengan handwashsebagian besar dari responden dilakukan (53%) pada langkah dan sebagian besar dari responden dilakukan(52,9%) pada moment. Dan pada hand hygiene dengan handrub pada langkah sebagian besar dariresponden dilakukan (52,9%) dan hampir setengah dari responden dilakukan (44,1%) pada moment. Halini menunjukan bahwa masih banyak penata anestesi yang tidak melakukan hand hygiene sesuai standaroperasional prosedur menurut WHO yaitu five moment dan 6 langkah. Diharapkan kepada penata anestesidapat meningkatkan penerapan hand hygiene five moment dan 6 langkah untuk meningkatkan pelayanankesehatan dalam menjaga penerapan hand hygiene untuk mencegah Healthcare Associated Infections(HAIs) dan kepada RS X untuk lebih mengoptimalkan monitoring ketersediaan sarana dan prasarana handhygiene. Kata Kunci: Hand Hygiene, Five moment, 6 Langkah, Penata Anestesi Perioperatif