Ulkus diabetikum merupakan komplikasi kronis diabetes melitus yang rentan mengalami infeksi oleh bakteri seperti Staphylococcus aureus dan Escherichia coli . Resistensi terhadap antibiotik mendorong pemanfaatan alternatif antibakteri dari bahan alam, salah satunya adalah tanaman pare belut ( Trichosanthes cucumerina ). Buah tanaman ini diketahui mengandung senyawa aktif seperti flavonoid, alkaloid, tanin, dan saponin yang memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektivitas antibakteri ekstrak buah pare belut terhadap S. aureus dan E. coli penyebab infeksi ulkus diabetikum. Desain penelitian ini adalah eksperimen in-vitro dengan pendekatan post-test only, menggunakan metode Kirby-Bauer. Ekstrak diuji pada konsentrasi 12,5%, 25%, dan 50%, disertai kontrol positif (Gentamisin dan Siprofloksasin) serta kontrol negatif (Aquades). Zona hambat digunakan sebagai indikator aktivitas antibakteri. Hasil menunjukkan bahwa ekstrak buah pare belut lebih efektif terhadap S. aureus (kategori intermediet) dibandingkan E. coli (kategori resisten), dengan peningkatan daya hambat seiring peningkatan konsentrasi. Temuan ini menunjukkan potensi ekstrak sebagai antibakteri alami, meskipun efektivitasnya belum menyamai standar antibiotik. Perbandingan dengan bagian lain dari tanaman pare belut seperti biji, daun, dan batang menunjukkan zona hambat yang lebih besar. Penelitian lanjutan disarankan dengan konsentrasi di atas 50% atau kombinasi antarbagian tanaman untuk meningkatkan efektivitas antibakteri.