Transportasi merupakan elemen vital dalam mendukung mobilitas masyarakat dan perkembangan ekonomi suatu wilayah. Salah satu moda transportasi yang masih banyak digunakan adalah angkutan kota, khususnya di Kota Ambon yang memiliki lebih dari 40 trayek aktif, termasuk trayek Mardika–Hatalai. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis Biaya Operasional Kendaraan (BOK) angkutan kota pada rute tersebut guna mengetahui efisiensi operasional dan keberlanjutan layanan transportasi. Metode yang digunakan adalah metode kuantitatif dengan pendekatan survei lapangan, wawancara langsung kepada sopir, serta pengumpulan data sekunder dari instansi terkait. Data dianalisis menggunakan metode perhitungan biaya operasional berdasarkan komponen biaya langsung dan tidak langsung sesuai dengan standar Ditjen Perhubungan Darat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BOK untuk kendaraan dengan plat DE 1650 LU (Suzuki Carry Futura) pada trayek Mardika– Hatalai mencapai Rp113.143.000 per tahun atau sekitar Rp2.954/km. Komponen biaya terbesar berasal dari bahan bakar dan penyusutan kendaraan. Temuan ini menegaskan pentingnya pengelolaan biaya secara efisien oleh pengusaha angkutan agar tetap memperoleh margin keuntungan yang layak tanpa menaikkan tarif penumpang secara signifikan. Penelitian ini juga mengidentifikasi bahwa fluktuasi harga BBM, kondisi jalan, dan jumlah penumpang per hari sangat mempengaruhi struktur biaya operasional. Oleh karena itu, diperlukan evaluasi berkala terhadap tarif dan kebijakan subsidi agar angkutan umum tetap menjadi pilihan utama masyarakat. Studi ini memberikan kontribusi empiris dalam perencanaan transportasi publik, khususnya dalam konteks wilayah perkotaan di Indonesia bagian timur.