Bulu ayam merupakan limbah yang dapat di daur ulang karena mengandung protein bernilai tinggi yang dapat dimanfaatkan untuk mikroorganisme. Namun, protein pada bulu ayam termasuk jenis protein keratin yang sulit dicerna oleh enzim protease umum karena adanya ikatan disulfida. Enzim protease spesifik yang dapat mendegradasi keratin pada bulu ayam adalah keratinase. Pada penelitian pendahuluan, telah berhasil mengisolasi bakteri penghasil keratinase Bacillus sp. MD24, diukur dengan pendekatan One Factor at A time (OFAT) melalui teknik solid state fermentation (SSF) menggunakan bulu ayam sebagai satu-satunya sumber karbon dan nitrogen, menghasilkan aktivitas keratinase sebasar 17 U/mL pada pH 8 dan 16 U/mL pada suhu 37oC yang diuji dengan substrat kasein. Namun, produksinya sangat dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungan mikroskopis dari bakteri, sehingga untuk memperoleh nilai aktivitas enzim keratinase yang maksimal diperlukan optimasi fermentasi keratinase. Pada penelitian ini, dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu (1) Skrining Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Fermentasi Keratinase melalui Pendekatan One Factor at A time (OFAT), (2) Penentuan Faktor-Faktor yang Berpengaruh Signifikan dengan pendekatan Plackett-Burman Design (PBD), dan (3) Penentuan Nilai Optimum Faktor-Faktor yang Berpengaruh Signifikan menggunakan pendekatan Central Composite Design-Response Surface Methodology (CCD-RSM). Tujuan penelitian ini untuk mengetahui nilai optimum dari faktor-faktor signifikan yang mempengaruhi fermentasi keratinase oleh Bacillus sp. MD24 menggunakan pendekatan tiga tahapan yaitu OFAT, PBD, dan CCD-RSM sehingga berdampak pada nilai aktivitas keratinase yang optimal. Hasil OFAT skrining tiga faktor yang mempengaruhi fermentasi keratinase oleh Bacillus sp. MD24 diperoleh nilai faktor dengan aktivitas keratinase tertinggi pada kondisi fermentasi yaitu suhu 37oC, pH 8, dan jumlah inokulum 1% (%v/v). PBD memberikan hasil dari ketiga faktor yang memiliki pengaruh signifikan terhadap fermentasi keratinase yaitu suhu dan pH, serta melalui pendekatan CCD-RSM diperoleh nilai optimum pada suhu 37,21oC dan pH 7,99, dengan nilai aktivitas keratinase prediksi sebesar 1848,35 ± 7,39 U/mL mendekati respon yang diamati secara aktual sebesar 1826,15 ± 8,92 U/mL.