Cakupan ASI eksklusif di Puskesmas Pekauman masih sangat rendah yaitu 4,79% dari 28 Puskesmas. Salah satu faktor yang memengaruhi keberhasilan pemberian ASI eksklusif adalah kurangnya pengetahuan ibu. Edukasi menggunakan video animasi sebagai media audiovisual diharapkan dapat meningkatkan pengetahuan Ibu Hamil Trimester III tentang pemberian ASI eksklusif. Penelitian bertujuan untuk mengetahui pengaruh edukasi Ibu Hamil Trimester III terhadap peningkatan pengetahuan pemberian ASI Ekslusif dengan media video animasi di Puskesmas Pekauman Banjarmasin Selatan. Penelitian menerapkan metode Pra-eksperimental desain Pretest-Posttest one group. Populasi adalah seluruh Ibu Hamil Trimester III di Puskesmas Pekauman, dengan jumlah kunjungan 53 orang. Pengambilan sampel menggunakan teknik purposive sampling, berjumlah 35 responden. Peneliti menggunakan data primer melalui kuesioner pengetahuan Pretest-postest dan data sekunder berupa buku KIA. Instrumen penelitian berupa lembar kuesioner, serta analisis data menggunakan uji Wilcoxon Signed Ranks Test. Hasil penelitian menunjukkan sebanyak 20 (57,1%) dari 35 ibu memiliki pengetahuan “cukup“ dan 15 (42,8%) memiliki pengetahuan “kurang“ sebelum intervensi, setelah intervensi 35 (100%) ibu memiliki pengetahuan “Baik“ . Hasil uji Wilcoxon Signed Ranks Test menunjukkan (Asymp. Sig. (2-tailed) = 0,000 < 0,005). Penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat pengaruh yang signifikan dari edukasi Ibu Hamil Trimester III menggunakan media video animasi terhadap peningkatan pengetahuan pemberian ASI eksklusif. Tenaga kesehatan di Puskesmas diharapkan dapat mengembangkan program edukasi berbasis video animasi, sebagai upaya meningkatkan pemahaman ibu hamil mengenai pentingnya ASI eksklusif.