Dampak penurunan kualiatas spermatozoa selama kriopreservasi semen akibat adanya reactive oxygen species (ROS) dapat diantisipasi dengan antioksidan. Antioksidan yang bisa digunakan adalah l-cysteine, selenium, dan kombinasinya. Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh penambahan antioksidan l-cysteine, selenium dan kombinasinya terhadap kualitas spermatozoa selama proses kriopreservasi semen sapi PO. Penelitian ini menggunakan 5 ekor sapi PO (5-10) tahun yang dipelihara di Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang. Semen dikoleksi dari 5 ekor sapi tersebut masing-masingn diambil 1 ejakulat dengan menggunakan vagina buatan. Setiap ejakulat dibagi menjadi empat bagian, masing-masing bagian diencerkan dengan kuning telur dan susu skim (pengencer A), dilanjutkan dengan pengencer B (gliserol, susu skim, glukosa, dan kuning telur) pada suhu 37oC. Bagian 1 (kontrol), bagian 2 (1 mM l-cysteine), bagian 3 (0,05 mM selenium), dan bagian 4 (kombinasi 1 mM l-cystein + 0,05 mM selenium), selanjutnya dimasukkan ke dalam cool top untuk di equilibrasi pada suhu 4oC selama 2-3 jam dan dilakukan pemeriksaan motilitas. Semen dimasukkan ke dalam straw dan dibekukan dalam container yang mengandung nitrogen cair. Thawing semen beku pada suhu 37oC elama 30 detik dilanjutkan dengan pemeriksaan motilitas spermatozoa, viabilitas spermatozoa, dan recovery rate. Hasil menunjukkan persentase motilitas, recovery rate, dan viabilitas spermatozoa yang paling tinggi adalah semen dengan penambahan l-cysteine (1mM) dan selenium (0,05 mM) berturut-turut pada nilai (48,00 ± 2,73), (67,60 ± 3,85), (67,88 ± 3,88) dan (46,00 ± 2,23), (64,78 ± 3,14), (65,10 ± 4,02). Simpulan menunjukkan bahwa antioksidan l-cysteine dan selenium dapat meningkatkan motilitas, recovery rate, dan viabilitas spermatozoa post thawing pada sapi PO.