Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kelayakan instrumen tes berbasis kemampuan berpikir kritis berlandaskan literasi sains pada materi pencemaran lingkungan dengan melihat aspek validitas, reliabilitas, tingkat kesukaran, daya beda, dan uji respon pada mahasiswa. Penelitian ini merupakan penelitian pengembangan dengan Analysis, Design, Development, Implementatiom, and Evaluation (ADDIE). Data penelitian ini diperoleh dengan mengujicobakan instrumen tes biologi yang dikembangkan berlandaskan literasi sains berupa tes essay sebanyak 20 soal. Analisis validasi isi menunjukkan bahwa sebanyak 17 soal valid. Reliabilitas instrumen 0,78, tingkat kesukaran 0,30-0,72 dan daya beda 0,04-0,72. Hasil uji respon diketahui 75% responden yang menyatakan sangat setuju dengan instrumen tes jenis ini. Berdasarkan kriteria tersebut, maka 14 soal telah dinyatakan baik dan layak digunakan sebagai instrumen tes biologi untuk melatih keterampilan berpikir kritis bagi mahasiswa. Intrumen tes yang dikembangkan telah masuk dalam kategori layak atau baik digunakan sebagai instrumen tes yang dapat melatih keterampilan berpikir kritis. Intrumen tes ini telah memenuhi kriteria validitas ahli dengan presentase 85% soal valid dan 15% soal tidak valid, reliabilitas 0,78 pada kategori tinggi, tingkat kesukaran 0,30 sampai 0,72, dan daya beda 0,04 sampai 0,72. Intrumen tes yang dikembangkan juga telah mendapat respon dengan presentase 75% pada kategori sangat baik dari responden.