Sepsis neonatorum merupakan penyebab signifikan kematian neonatorum dan morbiditas jangka panjang. Infeksi bakteri atipikal berperan penting dalam sepsis neonatorum, namun sulit dideteksi dengan teknik mikrobiologi konvensional. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi bakteri atipikal yaitu Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumonia, Legionella pneumophila dan Ureaplasma urealyticum dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks dari swab nasofaring pasien sepsis neonatorum yang dirawat di RS Wahidin Sudirohusodo Makassar. Penelitian ini merupakan penelitian observasional deskriptif pada neonatus dengan dugaan sepsis. Neonatus yang diduga sepsis akan diambil swab nasofaring kemudian diperiksa untuk mendeteksi Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumonia, Legionella pneumophila dan Ureaplasma urealyticum menggunakan PCR multipleks. Pemeriksaan pasien sepsis neonatorum yang dirawat di NICU RS Wahidin Sudirohusodo Makassar menggunakan sampel swab nasofaring pada bulan September 2022 hingga Juni 2023 menunjukkan bahwa dari 60 pasien yang diperiksa swab nasofaring, 8 (13,33%) pasien terdeteksi infeksi tunggal bakteri atipikal yaitu Mycoplasma pneumonia, Chlamydia trachomatis dan Legionella pneumophila serta 12 pasien (20%) di antaranya adalah infeksi multipel yaitu Mycoplasma pneumoniae dan Chlamydia trachomatis; Legionella pneumophila dan Chlamydia trachomatis; Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis dan Legionella pneumophila. PCR merupakan modalitas yang menjanjikan untuk mendeteksi bakteri atipikal dari swab nasofaring pasien sepsis neonatorum yang sulit diidentifikasi dengan teknik konvensional. Hal ini sangat berguna untuk memberikan terapi yang cepat dan tepat pada pasien sepsis neonatorum.