Tujuan dari penelitian ini untuk menguji penggunaan level gliserol (GLY) dalam pengencer sitrat-kuning telur (S-KT) guna mempertahankan kualitas spermatozoa babi Landrace pada suhu penyimpanan 18-20oC. Materi dalam penelitian ini yaitu semen segar dari satu ekor babi jenis Landrace berusia 2,5 tahun, kesehatan optimal, babi pejantan telah terbiasa dan dilatih untuk proses koleksi semen secara teratur. Penelitian ini disusun dengan metode rancangan acak lengkap yang mencakup lima perlakuan berupa Sitrat-Kuning telur dan gliserol dan lima pengulangan yakni: P0 = S-KT, P1: S-KT + GLY 1%, P2: S-KT + GLY 2%, P3: S-KT + GLY 3%, P4: S-KT + GLY 4%. Variabel yang diuji diantaranya: motilitas, viabilitas, abnormalitas, dan daya tahan hidup (DTH) spermatozoa. Setelah diencerkan, semen disimpan dalam styrofom box pada temperature 18-20oC. Data dianalisis menggunakan one way ANOVA bila terdapat perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan dengan uji Duncan. Hasil dari penelitian mengindikasikan bahwa perlakuan P2 pada jam pengamatan ke-36 menghasilkan kualitas spermatozoa dengan nilai yang lebih tinggi secara statistik (P<0,05) apabila dibandingkan keempat perlakuan lain dengan motilitas: 45,00±2,24%, viabilitas: 52,70±3,87%, abnormalitas: 4,20±0,89%, dan DTH spermatozoa: 41,45±8,05 jam. Simpulan dari penelitian ini adalah penggunaan gliserol pada tingkat konsentrasi 2% dalam larutan pengencer sitrat-kuning telur memberikan respon yang baik untuk menjaga kualitas spermatozoa babi Landrace hingga 41,45 jam penyimpanan. Kata kunci: Gliserol, Kuning telur, Sitrat, Spermatozoa babi Landrace