Tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) merupakan tanaman musiman bernilai ekonomi tinggi, namun produksinya di Indonesia terus mengalami penurunan dalam beberapa tahun terakhir. Penggunaan varietas hibrida dapat menjadi solusi karena memiliki produktivitas dan ketahanan penyakit yang lebih baik, tetapi pembentukannya secara konvensional memerlukan waktu lama. Teknik kultur antera dapat digunakan untuk mempercepat pembentukan galur murni karena menghasilkan tanaman homozigot hanya dalam satu generasi. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis interaksi antara jenis media kultur (MS dan Chu’s N6) dengan penambahan beberapa konsentrasi Nanopartikel silver (AgNPs) yaitu 0,0; 2,5; 5,0; 7,5; dan 10,0 mg L⁻¹ terhadap pertumbuhan antera tembakau secara in vitro. Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 10 perlakuan dan 3 ulangan, kemudian data dianalisis menggunakan ANOVA dan diuji lanjut DMRT dengan taraf kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa media MS merupakan media terbaik dalam mempercepat dan memperbanyak induksi swelling, kalus, tunas, dan akar, sedangkan konsentrasi AgNPs terbaik diperoleh pada 2,5 mg L⁻¹ yang mampu meningkatkan respons pertumbuhan serta sedikit mengurangi tingkat kontaminasi media. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi media MS dan AgNPs dosis rendah mampu meningkatkan efisiensi regenerasi antera tembakau dan berpotensi digunakan sebagai protokol standar dalam produksi galur murni secara cepat, efisien, dan steril di laboratorium kultur jaringan. ABSTRACT Tobacco (Nicotiana tabacum L.) is a seasonal crop with high economic value, but its production in Indonesia has continued to decline in recent years. The use of hybrid varieties can be a solution because they have better productivity and disease resistance, but their conventional formation requires a long time. Anther culture techniques can be used to accelerate the formation of pure lines because they produce homozygous plants in just one generation. This study aims to determine the interaction between the types of culture media (MS and Chu's N6) with the addition of several concentrations of silver nanoparticles (AgNPs), namely 0, 2.5, 5, 7.5, and 10 mg L⁻¹ on the growth of tobacco anthers in vitro. The study used a Completely Randomized Design (CRD) with 10 treatments and 3 replications, then the data were analyzed using ANOVA and further tested with DMRT at the 95% level. The results showed that MS medium was the best medium in accelerating and increasing the induction of swelling, callus, shoots, and roots, while the best concentration of AgNPs was obtained at 2.5 mg L⁻¹ which was able to increase the growth response and slightly reduce the level of media contamination. The findings of this study indicate that the combination of MS medium and low-dose AgNPs can increase the efficiency of tobacco anther regeneration and has the potential to be used as a standard protocol in the production of pure lines quickly, efficiently, and sterilely in tissue culture laboratories.