Pemberian antibiotik untuk mengatasi infeksi mikroba telah menyebabkan terjadinya kasus resistensi. Oleh sebab itu, diperlukan suatu senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan patogen, namun bersifat lebih aman. Telah diperoleh isolat dari pangan fermentasi melayu yaitu Isolat DTP1. Tujuan penelitian ini yaitu untuk menguji aktivitas antimikroba isolat DTP1, aktivitas hemolisis dan identifikasi molekuler isolat tersebut. Metode yang digunakan yaitu eskperimental, yang diawali dengan isolasi mikroba dari sampel, uji antimikroba, uji hemolisis agar darah dan identifikasi molekuler. Data yang ditemukan selanjutnya disajikan dalam bentuk tabel dan gambar, lalu dianalis secara deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat DTP1 mampu menghambat pertumbuhan E.coli (10,06 mm) dan S.aureus (10,63 mm). Isolat DTP1 berdasarkan uji hemolisis darah bersifat non hemolitik atau bersifat aman. Hasil identifikasi molekuler menggunakan sekuens 16S rDNA ditemukan bahwa isolat ini memiliki panjang berkisar 1550 bp danĀ 99,1% similar dengan B.subtilis. Hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa isolat DTP1 yang ditemukan pada penelitian ini yaitu Bacillus subtilis. Bakteri tersebut memiliki aktivitas antimikroba terhadap S. aureus dan E. coli dan bersifat gamma hemolitik atau non patogen.