Deteksi cairan mani dalam kedokteran forensik sangat penting untuk pembuktian adanya kasus pidana, khususnya pada kasus kekerasan seksual, khususnya kasus persetubuhan. Kristal kolin dapat diketahui dalam konsentrasi tinggi pada cairan mani menggunakan pengujian Florance iodine (FI). Uji FI ini telah digunakan dalam ilmu forensik selama bertahun-tahun, namun sangat sedikit yang didokumentasikan mengenai optimalisasi, ketahanan dan masa kadaluwarsa reagen FI tersebut dalam praktik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui optimalisasi konsentrasi iodin pada Reagen FI termasuk dengan ketahanan asam basa. Uji optimalisasi konsentrasi didapatkan bahwa konsentrasi optimum iodine pada reagen FI adalah 10%, didapatkan pula ketahanan reagen FI pada pH asam adalah 1 dan pada pH basa adalah 8. Reagen Florance Iodine merupakan salah satu metode kimia yang digunakan dalam forensik untuk mendeteksi keberadaan cairan mani melalui reaksi dengan kolin. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimalkan penggunaan reagen Florance Iodine dengan mengevaluasi sensitivitas dan spesifisitasnya dalam berbagai kondisi asam-basa. Pengujian dilakukan dengan variasi pH dan konsentrasi reagen untuk menentukan parameter yang paling efektif dalam menghasilkan perubahan warna yang jelas dan spesifik. Hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan akurasi metode deteksi forensik, terutama dalam kondisi sampel yang telah mengalami degradasi lingkungan. Hasil eksperimen menunjukkan bahwa reagen Florance Iodine mampu memberikan hasil yang lebih akurat dalam rentang pH tertentu, dengan warna reaksi yang lebih intens pada kondisi asam lemah. Uji ketahanan asam-basa juga mengungkap bahwa stabilitas reaksi dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti suhu dan paparan udara. Selain itu, penelitian ini menemukan bahwa penyesuaian konsentrasi iodine dalam reagen dapat meningkatkan sensitivitas deteksi tanpa meningkatkan risiko reaksi positif palsu.Implikasi dari penelitian ini sangat penting dalam bidang forensik, terutama dalam kasus kekerasan seksual dan investigasi kriminal yang memerlukan analisis bukti biologis. Dengan optimalisasi reagen Florance Iodine, metode deteksi cairan mani dapat menjadi lebih andal dan dapat digunakan dalam berbagai kondisi lingkungan yang menantang. Penelitian lanjutan diperlukan untuk mengembangkan formulasi reagen yang lebih stabil serta menguji efektivitasnya dalam skenario forensik yang lebih luas. Kata Kunci : Kedokteran Forensik, Kristal kolin, FI, Spektroskopi Raman, FT-IR, Kekerasan Seksual, Air mani (semen)