Limbah tandan kosong kelapa sawit (TKKS) merupakan biomassa lignoselulosa yang terdiri dari lignin, selulosa, dan hemiselulosa, yang dapat dimanfaatkan lebih lanjut menjadi produk bernilai tinggi. Namun, diperlukan degradasi karena lignoselulosa bersifat rekalsitran. Proses degradasi lignoselulosa memanfaatkan kinerja jamur pelapuk coklat, dalam hal ini Serpula lacrymans, yang memiliki kemampuan degradasi berdasakan pembentukan radikal oksidatif pada pelapukan kayu. Oleh karena itu diperlukan optimasi pada faktor yang mendukung proses degradasi selama inkubasi oleh Serpula lacrymans pada tandan kosong kelapa sawit. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui kondisi optimal faktor glukosa sebagai nutrisi karbon (C), urea sebagai nutrisi nitrogen (N), dan lama waktu inkubasi jamur selama proses degradasi. Metode penelitian menggunakan Response Surface Methodology (RSM) program Design Expert 13.0 dengan mengoptimasi faktor penambahan glukosa, penambahan urea, serta waktu inkubasi untuk memperoleh hasil degradasi TKKS optimal oleh Serpula lacrymans. Terdapat empat respon pada penelitian ini, yaitu total soluble phenol (TSP), total gula reduksi (TGR), pH, dan susut berat. Hasil respon menunjukkan bahwa TGR dan pH disarankan model kuadratik, sedangkan pada respon TSP dan susut berat adalah linier. Solusi optimal diperoleh pada konsentrasi glukosa 20 g/L, konsentrasi urea 0,5 g/L, dan waktu inkubasi 21 hari, dengan nilai desirability 0,906. Validasi solusi optimasi menghasilkan nilai nilai TSP 0,027 mg/g, TGR 5,834 mg/g, nilai pH 5,810, serta susut berat 14,336%, di mana semua nilai berada pada rentang 95% PI.