Seleksi hewan berdasarkan jenis kelamin merupakan strategi penting dalam program pemuliaan dan produksi ternak karena berpengaruh terhadap efisiensi produksi dan nilai ekonomi. Peningkatan kebutuhan daging sapi mendorong penerapan teknologi reproduksi yang efisien, salah satunya melalui sexing sperma. Metode swim-up merupakan teknik sexing sperma yang relatif sederhana dan ekonomis. Namun, pada sapi bali, efektivitas metode ini masih perlu dikaji lebih spesifik terutama terkait pengaruh durasi inkubasi dan kadar albumin terhadap pemisahan spermatozoa X dan Y serta kualitas spermatozoa yang dihasilkan. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh variasi durasi inkubasi dan kadar albumin terhadap kualitas semen beku sapi bali hasil sexing menggunakan metode swim-up, serta mengevaluasi proporsi spermatozoa X dan Y dan kualitas kromosom sperma setelah proses sexing. Penelitian menggunakan pendekatan eksperimental kuantitatif dengan parameter pengamatan meliputi motilitas, viabilitas, abnormalitas, morfometrik sperma, proporsi spermatozoa X dan Y, serta kualitas kromosom sperma. Hasil penelitian menunjukkan bahwa variasi durasi inkubasi dan kadar albumin berpengaruh signifikan (p<0,05) terhadap kualitas sperma. Perlakuan inkubasi 15 menit dengan albumin 3% menghasilkan kualitas sperma terbaik dengan motilitas 14,00±6,02, viabilitas 26,67±7,57, dan abnormalitas terendah 5,67±5,50. Morfometrik sperma pasca sexing masih berada dalam kisaran normal. Proporsi spermatozoa X dan Y menunjukkan variasi antar perlakuan, dengan kecenderungan fraksi kromosom kelamin tertentu pada perlakuan optimal. Hasil skrining kromosom menunjukkan mayoritas spermatozoa memiliki kromosom yang utuh. Dengan demikian, metode swim-up diharapkan efektif digunakan untuk memisahkan spermatozoa berdasarkan kromosom kelamin tanpa menurunkan kualitas kromosom sperma sapi bali.