Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh variasi konsentrasi H₂SO₄ pada tahap hidrolisis kulit singkong serta menentukan kondisi yang paling efektif untuk menghasilkan glukosa sebagai substrat utama fermentasi bioetanol. Kulit singkong dipilih karena kandungan pati dan selulosanya yang tinggi serta ketersediaannya yang melimpah sebagai limbah agroindustri. Proses hidrolisis dilakukan dengan variasi konsentrasi H₂SO₄ (0,1 N; 0,3 N; 0,6 N; 0,8 N; dan 1 N), dilanjutkan tahap fermentasi menggunakan Saccharomyces cerevisiae dengan penambahan urea sebagai sumber nitrogen. Fermentasi dilakukan selama 3 dan 5 hari guna mengkaji pengaruh lama fermentasi terhadap akumulasi etanol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hidrolisis dengan konsentrasi H₂SO₄ 0,6 N menghasilkan kadar glukosa tertinggi sebesar 7,0 °Bx, yang berkontribusi pada pembentukan etanol maksimum sebesar 9,8% pada hari ketiga fermentasi. Setelah hari ketiga, kadar etanol menunjukkan kecenderungan menurun. Dengan demikian, konsentrasi H₂SO₄ 0,6 N dapat disimpulkan sebagai kondisi paling optimal untuk proses hidrolisis kulit singkong dalam mendukung produksi bioetanol.