Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji hubungan kekerabatan populasi Drosophila dari tiga lokasi di Jawa Timur, yaitu Besuki, Bangil, dan Lumajang, berdasarkan karakter morfologi. Sampel diperoleh melalui penangkapan langsung dan diamati menggunakan parameter panjang tubuh, lebar sayap, dan intensitas pigmen. Analisis deskriptif, Principal Component Analysis (PCA), dan analisis klaster digunakan untuk menentukan pola variasi dan kedekatan morfologi antar populasi. Hasil penelitian menunjukkan adanya variasi signifikan pada ketiga parameter, di mana populasi Besuki dan Bangil menunjukkan ukuran tubuh lebih besar dibandingkan Lumajang. Pigmentasi tubuh populasi Bangil lebih gelap dibandingkan dua lokasi lainnya. Analisis PCA dan klaster menunjukkan kedekatan kekerabatan Besuki–Bangil, sedangkan Lumajang membentuk kelompok tersendiri. Variasi ini diduga dipengaruhi oleh kondisi lingkungan lokal, faktor genetik, dan aspek biotik. Hasil penelitian ini menegaskan potensi penggunaan morfologi Drosophila sebagai indikator awal hubungan kekerabatan dan adaptasi lokal.