Pendahuluan: Karies merupakan penyakit jaringan keras pada gigi yang disebabkan oleh asam hasil bakteri plak yang menumpuk pada permukaan gigi. Salah satu bakteri plak adalah Streptococcus mutans. Penggunaan obat kumur Chlorhexidine gluconate 0,2% terbukti mampu menghambat S.mutans. Namun penggunaan Chlorhexidine gluconate 0,2% dalam jangka panjang dapat menimbulkan efek samping. Oleh karena itu, diperlukan bahan alami seperti tanaman biduri yang memiliki efek antibakteri untuk menghindari efek samping tersebut. Penelitian ini bertujuan menganalisis ekstrak daun biduri (Calotropis gigantea) dapat menghambat pertumbuhan S.mutans. Metode: Jenis penelitian eksperimental laboratorium. Penelitian ini menggunakan 6 kelompok perlakuan yaitu kelompok perlakuan ekstrak daun biduri dengan konsentrasi 15%, 20%, 25%, 30%, K(-) akuades, dan K(+)Chlorhexidine gluconate 0,2%. Kelompok perlakuan dan kelompok kontrol dipaparkan S.mutans untuk melihat efek antibakterinya dan menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis dan hitung koloni bakteri (total plate count). Hasil: Hasil penelitian menunjukkan, masing-masing konsentrasi menunjukkan hasil laju penghambatan sebesar 0 pada kelompok K(-), 45,78% pada kelompok 15%, 34,93% pada kelompok 20%, 76,5% pada kelompok 25%, 64,45% pada kelompok 30%, dan 89,45% pada kelompok K(+). Hasil hitung koloni bakteri penghambatan bakteri terbesar yaitu pada konsentrasi 25%. Hasil yang diperoleh dilakukan analisis data. Data sebelum dan sesudah inkubasi dilakukan uji Paired T Test dan menunjukkan perbedaan yang signifikan. Analisis data laju penghambatan dilakukan dengan uji Kruskal Wallis dilanjutkan uji Mann Whitney Ekstrak daun biduri konsentrasi 15% dibandingkan dengan konsentrasi 20% dan 30% dibandingkan dengan 25% memiliki nilai p>0,05 sehingga tidak memiliki perbedaan yang bermakna. Simpulan: Daun biduri efektif menghambat pertumbuhan S.mutans.Antibacterial effectiveness test of biduri leaf (Calotropis gigantea) against Streptococcus mutans: experimental laboratory studyIntroduction: Caries is a disease that affects the hard tissue of the teeth, caused by acid deposits produced by plaque bacteria that accumulate on the tooth surface. One of the plaque bacteria is Streptococcus mutans. Chlorhexidine gluconate 0.2% mouthwash has been shown to inhibit S. mutans. However, prolonged use of Chlorhexidine gluconate 0.2% mouthwash can cause side effects. To avoid these side effects, natural ingredients like biduri plant that have antibacterial effects are needed. This research aims to analyze the inhibitory effects of biduri (Calotropis gigantea) leaf extract on the growth of S. mutans. Methods: This research is experimental laboratory study. Six treatment groups were used, four groups treated with biduri leaf extract at concentrations of 15%, 20%, 25%, 30%; the K(-) using distilled water,; and K(+) using Chlorhexidine gluconate 0.2%. The treatment and control group were exposed to S. mutans to evaluate its antibacterial effect and assessed using the UV-Vis spectrophotometric and total plate count method. Results: In the research conducted, each concentration showed varying inhibition rates. The inhibition rates observed were as follows: 0% for the K(-), 45,78% for the 15% group, 34,93% for the 20% group, 76,5% for the 25% group, 64,45% for the 30% group, and 89,45% for the K(+). In bacterial colony count, the greatest bacterial inhibition was observed at concentration of 25%. Statistical analysis was performed on the obtained data. A Paired T-Test demonstrated a significant difference between the data before and after incubation. Further analysis using the Kruskal Wallis and Mann Whitney tests revealed no significant difference in inhibition rates between 15% and 25% concentrations, or between 25% and 30%. Conclusion: Biduri leaf extract effectively inhibits the growth of S. mutans.