Pekasam merupakan salah satu makanan tradisonal yang berbahan dasar ikan yang dibuat dengan proses fermentasi. Pembuatan pekasam secara tradisional dilakukan dengan fermentasi spontan sehingga mempunyai karakteristik yang tidak konsisten. Penelitian ini bertujuan menentukan isolat bakteri asam laktat (BAL) dari pekasam tradisional sebagai kultur starter untuk fermentasi pekasam skala laboratorium. Sampel pekasam tradisional diperoleh dari tiga perajin pekasam asal Kabupaten Sambas Kalimantan Barat (SB1, SB2 dan SB3). Hasil isolasi BAL dari ketiga sampel pekasam diperoleh 34 isolat. Isolat memiliki bentuk bulat, tepian rata, dan permukaan cembung. Koloni yang ditemukan terdiri atas 32 koloni berwarna putih susu dan 2 koloni berwarna putih kekuningan. Isolat merupakan gram positif, 31 sel berbentuk basil dan 3 sel berbentuk kokus. Isolat BAL yang terseleksi dari pengujian proteolitik dan hemolitik ada 6 isolat, yaitu SB1.1, SB1.5, SB2.4, SB3.1, SB3.2 dan SB3.8. Berdasarkan nilai indeks proteolitik dipilih tiga isolat (SB1.1, SB1.5, dan SB2.4) sebagai kultur starter dalam pembuatan pekasam skala laboratorium. Hasil penelitian menunjukkan penambahan kultur starter dalam pembuatan pekasam berpengaruh nyata terhadap kadar abu, protein, lemak, dan serat pekasam yang dihasilkan, namun tidak berpengaruh terhadap kadar air pekasam. Kadar abu pekasam skala laboratorium adalah 7,12-7,32%; protein 12,68-13,07%; lemak 5,43-8,80%; karbohidrat 6,97-10,45%; serat 7,58-7,90%, energi 143,85-162,18 kal/100g, dan air 55,87-56,4%.