Air limbah proses pengolahan gula yang dikumpulkan berasal dari pabrik gula X dari di Selangor. Inokulum mikroba diperoleh dari mikroflora yang terdapat dalam lumpur sedimentasi pada instalasi pengolahan air limbah. Proses pengolahan dilakukan dalam kondisi gelap, dengan parameter operasi utama meliputi pH, ukuran inokulum, dan suhu temperatur. Parameter yang diamati mencakup kebutuhan oksigen kimiawi (COD), total padatan tersuspensi (TSS), pH, dan produksi biogas. Inokulum diinkubasi selama dua hari menggunakan substrat berupa air limbah pengolahan gula, dengan pH disesuaikan menjadi 5,0 untuk menghambat aktivitas bakteri metanogenik. Pengolahan dilakukan dalam vial tertutup dengan volume kerja sebesar 10 mL. Studi pendahuluan menunjukkan bahwa waktu optimum pengolahan adalah 60 jam, berdasarkan efisiensi penurunan COD dan volume biogas yang dihasilkan. Dalam eksperimen utama, parameter operasi divariasikan, yaitu ukuran inokulum (10%, 20%, 30%) dan temperatur (30°C, 35°C, 40°C). Proses ini mampu menurunkan COD hingga 82%, serta mikroflora yang digunakan menunjukkan kemampuan menghasilkan biogas hingga 1,6 mL per 10 mL limbah. Penurunan pH selama proses pengolahan diamati sebagai akibat aktivitas bakteri penghasil asam (asidogenik). Selain itu, terjadi peningkatan signifikan pada TSS, dengan kenaikan maksimum mencapai 460%, yang mengindikasikan pertumbuhan mikroba dan akumulasi biomassa. Kata Kunci: air limbah pabrik gula, microflora, pengolahan anaerobik, penyisihan COD, ukuran inoculum,