Tuberkulosis paru adalah penyakit menular yang disebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis (MTB). Pemeriksaan mikroskopis Bakteri Tahan Asam (BTA) merupakan pemeriksaan yang penting untuk membantu diagnosis tuberculosis paru. Penderita tuberculosis paru dapat mengalami peningkatan jumlah BTA apabila mengalami defisiensi vitamin D. Vitamin D dapat menghambat multiplikasi MTB dalam makrofag dengan induksi peptida anti mikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kadar vitamin D3 dengan derajat kepositifan bakteri tahan asam pada penderita tuberkulosis paru. Jenis penelitian ini adalah observasional analitik dengan desain cross sectional. Sampel penelitian sebanyak 30 responden diambil dari Puskesmas Bangetayu, Puskesmas Tlogosari Wetan, dan Puskesmas Kedungmundu di Kota Semarang. Sampel tersebut diperiksa BTA secara mikroskopis dan pemeriksaan vitamin D3 dilakukan dengan metode Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Hasil pemeriksaan BTA menunjukan sebanyak 12 (40,0%) penderita dengan hasil scanty, sebanyak 7 (23,3%) penderita positif 1, sebanyak 7 (23,3%) penderita positif 2 dan 4 (13,4%) penderita positif 3. Hasil pemeriksaan vitamin D menunjukan sebanyak 23 (76,7%) penderita dengan status defisiensi, 5 (76,7%) penderita dengan status insufisiensi dan 2 (6,7%) penderita dengan status sufisiensi. Data tersebut dianalisa secara statiskik menggunakan uji Spearman dengan hasil p-Value = 0,023 (p< 0,05) sehingga dapat disimpulkan terdapat hubungan kadar vitamin D3 dengan derajat kepositifan BTA pada penderita tuberculosis paru.