Piperin adalah senyawa marker bagi tanaman dengan famili Piperaceae. Senyawa ini mempunyai rasa yang khas dan dijadikan rempah- rempah, sumber makanan, dan diaplikasikan sebagai pengobatan tradisional jamu dan senyawa ini berguna pada berbagai penyakit sebagai antiproliferative, antitumor, antiangiogenesis, antioksidan, antidiabetes, antiobesitas, kardioprotektif, antimikroba, antipenuaan, hepatoprotektif, anti-alergi, anti-inflamasi, neuroprotektif, dan efek imunomodulator. Pengujian kadar piperin sebagai kontrol kualitas diperlukan pada obat tradisional karena piperin merupakan senyawa aktif berkhasiat sekaligus sebagai senyawa mayor dalam beberapa tanaman khususnya genus Piper. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan validasi metode analisis senyawa piperin dan mendeteksi marker senyawa piperin dalam obat tradisional menggunakan KLT-Densitometri. Penelitian ini bersifat eksperimental meliputi validasi metode analisis senyawa piperin dengan konsentrasi 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm, dan 50 ppm dan deteksi piperin dalam jamu CM, Jamu AU, dan jamu PS konsentrasi 100 ppm menggunakan KLT sebagai fase diam, dan heksan: etil asetat (2:1 v/v) sebagai fase gerak dan pada panjang gelombang 340 nm. Hasil penelitian menunjukkan koefisien determinasi pada untuk parameter lineritas yaitu 0,9985, simpangan deviasi (SD) 0,0004 – 0,0088, koefisien variasi 0,04-1,04, % recovery 92.46% - 105.65%, LoD = 2.93 ppm, dan LoQ = 9.79 ppm. Untuk pengujian kadar piperin dalam jamu, marker piperin dalam jamu dapat ditemukan dengan nilai Rf 0,37, dan kandungan kadar piperin terdeteksi dalam Jamu CM 66,49 ppm > Jamu AU 4,64 ppm > jamu PS 1,9 ppm. Penggunaan KLT Densitometri dalam validasi metode analisis dan kontrol kualitas senyawa dalam produk jamu dapat dilakukan dan menghasilkan nilai sesuai dengan syarat validasi dan mendeteksi marker senyawa dalam jamu dapat diaplikasikan dengan KLT-densitometri.